Browsing by Author "劉曉蓉"

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    重組嗜熱嗜鹼性 Archaeoglobus fulgidus 脂肪酶之結構與功能分析
    (2009) 劉曉蓉; Hsiao-Jung Liu
    從嗜高溫古生菌Archaeoglobus fulgidus 基因體所選殖的新型脂肪酶(lipase) 基因AFL 已經成功地在大腸桿菌中被表達，並且以X-ray 結晶繞射的方法解出立體結構。Archaeoglobus fulgidus lipase(AFL) 為嗜熱性與嗜鹼性的脂肪酶，由474 個胺基酸組成，包含18個胺基酸的訊息胜肽以及456 個胺基酸的mature lipase (mAFL)，其結構上分為N-端以及C-端，活性中心位於N-端，C-端則含有受質脂肪酸官能基結合部位。本研究主要藉由蛋白質工程和生化分析，配合蛋白質立體結構的觀察，探討AFL 之結構與功能的關係，並找出對脂肪酶活性有影響的胺基酸。在AFL 的立體結構中，發現在兩個功能區域交界之處有許多的ion pairs，其中一對(K184、D370 及E372)以基因定位突變的方式破壞正負電荷引力之後，發現突變種K184A 、D370N 與E372Q 之活性顯著下降，分析K184A 後發現，最適反應溫度由野生種的70~90℃ 改變為僅侷限於90℃，顯示ion pair在兩個區域的交互作用扮演重要的角色。在脂肪酶與受質的結合部位中，推測對受質結合有影響的三個胺基酸：A32，S332 與E339 ，由基因定位突變後，突變種A32W 的受質專一性和野生種的長碳鏈相比，改變為中碳鏈之酯類，並且對中短鏈長的脂肪酸活性比野生種XIII高；而突變種S332W 與E339W 的活性皆低於野生種。在進行X-ray 結晶時觀察到鈣或鎂離子結合於C- 端區域的 D405、D409與D431 上，經由酵素動力學實驗及熱穩定性實驗發現，鈣離子的結合在高溫反應下，有助於AFL 與受質的親和力，並在90℃時穩定酵素結構，鎂離子則沒有幫助，證明鈣離子對於脂肪酶在高溫下有提升穩定性的影響。以三酸甘油脂為受質，分析AFL 的活性後發現有介面活化作用產生，亦即當三酸甘油質達到不溶於水的濃度時，AFL 的活性急遽上升，因此證明了AFL 確實為一脂肪酶而非酯酶，其結構上的口蓋（lid）可能會隨著油水介面的產生而開啟。由鈣離子結合部位的突變種分析，以酵素動力學和熱穩定性的實驗證明D405、D409 與D431 為鈣離子結合部位。以上結果闡述了此嗜熱、嗜鹼的脂肪酶特性以及催化機制和結構上的關係，並提供未來改造AFL 的線索，以因應在生物技術上的應用。